Blue Genes

Die Bakterien

E. coli K12 (JM109)

Bei den verwendeten Bakterien handelt es sich um den Escherichia coli (E. coli) Sicherheitsstamm K12, der weder den menschlichen Darm besiedeln kann, noch außerhalb des Labors lebensfähig ist. Es fehlen ihm hierzu bestimmte Eigenschaften, die der Wildtyp von E. coli besitzt. Das lacZ-Gen, welches wir im Klonierungsexperiment einsetzen, kommt natürlicherweise im Wildtyp von E. coliund auch in vielen Stämmen von E. coli K12 vor. In dem Stamm E. coli K12 des Typs JM109, der in den Experimenten mit dem Genbaukasten verwendet wird, ist das lacZ-Gen jedoch nicht funktionsfähig. Erst durch unser Klonierungsexperiment erhält der Stamm E. coli K12 (JM109) ein intaktes lacZ-Gen. Man spricht daher von einer Selbstklonierung. Es entsteht dadurch kein gentechnisch veränderter Organismus (GVO) im Sinne des Gentechnikgesetzes (GenTG). Somit entfällt die Anwendung des GenTG auf die mit dem Kit durchgeführten Arbeiten.

Es besteht keine Genehmigungspflicht für die hier beschriebenen Selbstklonierungs-Experimente.

Genetische Marker des Sicherheitsstammes Escherichia coli K12 (JM109)

{ e14- (McrA- ), recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rK- ,mK+ ), supE44, relA1, D(lac-proAB), [F' , traD36, proAB, lacIq ZDM15]}

Chromosomale Änderungen:

  • e14- (McrA- )
    Beschreibt einen Bereich des E. coli Chromosoms, den man leicht entfernen kann, weil er auf dem e14- Prophagen Element liegt. e14 trägt auch das McrA Gen, so daß alle Stämme die den e14 Prophagen nicht mehr tragen, automatisch McrA - sind. Ihnen fehlt die Möglichkeit, fremde DNA, die eine Modifikation am Adenosin trägt, abzubauen. Diese Änderung ist willkommen, da man fremde DNA klonieren will, und diese nicht vorzeitig abgebaut werden soll.
  • recA 1
    Verhindert die ungewollte Rekombination fremder DNA in das Chromosom.
  • endA 1
    Die Mutation, genannt endA, in der DNA spezifischen Endonuklease verhindert, daß fremde DNA angegriffen wird; damit wird die Klonierungsausbeute erhöht.
  • gyrA96
    Mutation im Gyrase-Gen.
  • thi-1
    Defekt an einem Gen der Thiamin-Biosynthese. Die Zelle benötigt daher Thiamin als Zusatz. Ohne diesen Zusatz im Medium ist sie nicht lebensfähig. Dieses ist eine sogenannte biologische Sicherheitsmaßnahme.
  • hsdR17(rK- mK- )
    Das chromosomale Restriktions-Modifikationssystem ist ausgeschaltet.
  • supE44
    Suppressor der UAG Mutation. Verändertes Gen für die tRNA von Glutamin, das bedingt, daß UAG als "nonsense" -Mutation in einem beliebigen Gen überlesen wird und statt Synthesestopp die Aminosäure Glutamin eingebaut wird.
  • relA1
    Wachstumsrate und Biosynthese von Ribosomen sind normalerweise strikt miteinander gekoppelt. Bei relA1-Stämmen findet man dies nicht mehr im selben Ausmaß.
  • D (lac-proAB)
    Das Chromosom hat den gesamten Bereich lac-proAB verloren; d.h. es trägt keine Gene für den Laktoseabbau und die Prolinsyn-these.

Episomale Änderungen:

  • F'
    Das Bakterium enthält ein verändertes F-Plasmid.
  • traD36
    Mutation in einem für den konjugativen Transfer verantwortlichen Gen.
  • proAB
    Bakterienzellen, die das F'-Plasmid tragen, können wieder Prolin synthetisieren und daher auf Minimalmedium wachsen.
  • laclq Z D M15
    Auf dem F'-Plasmid befindet sich eine Kopie des lac-Repressors lac I, unter der Kontrolle eines mutierten Promotors. Auf dem F'-Plasmid ist das lacZ-Gen nur fragmentarisch vorhanden (Auf dem Chromosom ist das lac-Operon völlig deletiert).
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