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Arbeitshinweise

Anweisungen zur Arbeit mit den im Koffer enhaltenen Geräten

Beachten Sie bitte auch die beiliegenden ausführlicheren Bedienungsanleitungen der Gerätehersteller.

Elektrophoresekammer SubCell GT

Überprüfen Sie vor dem Experimentieren, ob die Elektrophoresekammer unbeschädigt ist und keine Flüssigkeit austreten kann. Kabel, Stecker und Anschlußbuchsen müssen rostfrei und unbeschädigt sein. Stellen Sie das Gerät auf der Laborbank auf und überprüfen Sie mit der Libelle, ob die Kammer eben steht. Nach der erfolgten Elektrophorese kann der benutzte Elektrophoresepuffer in einer Flasche aufbewahrt und wiederverwendet werden. Spülen Sie die Elektrophoresekammer gut mit klarem Wasser und anschließend kurz mit destilliertem Wasser aus.

Netzgerät PowerPac 300

Stellen Sie das Netzgerät so auf, daß die Lüftungsschlitze an der Rückseite frei bleiben. Schließen Sie das Netzgerät mit dem dreiadrigen Kabel an eine geerdete Netzsteckdose an. Nachdem Sie den Deckel der Kammer geschlossen haben, stecken Sie die Kabel der Elektrophoresekammer, entsprechend den Farben des Plus- und Minuspols (rot und schwarz) in ein Buchsenpaar an der Front des Netzgerätes. Schalten Sie das Gerät ein. Der Netzschalter befindet sich an der rechten Seitenwand, die Netzanzeige (Leuchtdiode) an der Frontseite rechts. Mit dem Tastenpaar (ganz links) stellen Sie die Spannung auf 100 Volt ein. Starten Sie die Elektrophorese mit der Starttaste ganz rechts. Beobachten Sie, wie sich der Farbstoff im Gel in Richtung der Anode bewegt. Nach ca. 15 Minuten stoppen Sie die Elektrophorese durch erneutes Drücken der Starttaste. Ziehen Sie zuerst die Kabelverbindungen zur Gelkammer heraus. Öffnen Sie erst dann deren Deckel!

Hinweise vor Beginn der Arbeiten

In der vorliegenden Anleitung wird die Vorgehensweise des Experimentierens Schritt für Schritt erläutert.
Machen Sie sich vor Beginn der Arbeiten mit der kompletten Anleitung vertraut. Neue Begriffe werden im Glossar erklärt. Bereiten Sie Ihre Versuche gründlich vor. Planen Sie den exakten zeitlichen Ablauf der Experimente.

Geräte
Vergewissern Sie sich vor Beginn, daß Wasserbad und Brutschrank korrekt funktionieren. Machen Sie sich mit der Mikropipette vertraut. Sie ist das wichtigste Werkzeug bei molekularbiologischen Arbeiten. Lesen Sie dazu die beiliegenden Bedienungsanleitung.

Reagenzien
Es ist zu beachten, daß im Reagenzienkit mehrere biochemische Reagenzien (Enzyme, Nukleinsäuren und Puffer) in kleinen Volumina geliefert werden und daß hier kontrolliert werden muß, ob sich die Gesamtmenge der Lösung in der Spitze des Gefäßes befindet - andernfalls sollte zentrifugiert oder die Flüssigkeit heruntergeschüttelt werden (vgl. Fieberthermometer).
Nach möglichst kurzer Auftauzeit sollten die Reagenzien immer auf Eis stehen. Beim Pipettieren der Reaktionsansätze sollte das Enzym jeweils zuletzt zugegeben werden. Die meisten Puffer liegen in 10fach-konzentrierter Form vor. Es muß jedoch nur der TBE-Puffer vor Gebrauch verdünnt werden. Die Mengen der Puffer für Restriktionsenzyme und T4 DNA-Ligase sind so gewählt, daß sich die richtigen Konzentrationen im Ansatz automatisch ergeben.

Bakterien
Die für eine Transformation vorbereiteten kompetenten Bakterien werden in molekularbiologisch arbeitenden Laboratorien bei –80 °C aufbewahrt. Im ***-Gefrierfach eines normalen Kühlschranks (etwa –20 °C) würden sie die Fähigkeit, DNA aufzunehmen, innerhalb weniger Stunden verlieren. Sie werden deshalb in einem isolierenden Styroporbehälter, der mit Trockeneis (festes Kohlendioxyd) gefüllt ist, verschickt und können darin einige Tage aufbewahrt werden. Bestellen Sie die kompetenten Bakterienzellen so, daß sie am Wochenanfang versandt werden um auszuschließen, daß die Zellen unnötig lange lagern (z.B. über das Wochenende oder schulfreie Tage). Um das Gelingen des Experiments nicht zu gefährden, sollten Sie sich, bevor Sie die kompetenten Bakterien anfordern, mit dem Versuchsablauf vertraut gemacht und alle notwendigen Vorbereitungen getroffen haben.

Das Klonierungsexperiment muß innerhalb weniger Tage nach dem Eintreffen der Bakterien durchgeführt werden.

Im Folgenden wollen wir Ihnen einige Hinweise des Robert-Koch-Institutes (RKI) und der Zentralen Kommission für die biologische Sicherheit (ZKBS) zu GVOs und den Labor-Sicherheitsstämmen von E. coli, sowie eine Liste der vom RKI bewerteten Organismen im PDF-Format anbieten.

  • Zur guten Laborpraxis gehört es, Bakterien abzutöten, bevor sie entsorgt werden.
  • Sammeln Sie daher alle Materialien, die mit den Bakterien in Berührung gekommen sind (Pipettenspitzen, Eppendorfgefäße und Petrischalen), in den mitgelieferten Plastikbeuteln. In diesen Beuteln kann der Abfall durch halbstündiges Kochen in einem Dampfdrucktopf mit wenig Wasser sterilisiert werden. Anschließend entsorgen Sie den Abfall mit dem normalen Hausmüll.

Bitte beachten Sie:

  • Überall in der Umgebung, auch in der Luft schwebend, gibt es Mikroorganismen (Bakterien und Pilzsporen), die Geräte und Materialien kontaminieren.

Einige Vorsichtsmaßnahmen verringern die Gefahr von Kontaminationen beim Experimentieren:

  • Schließen Sie vor dem Experimentieren Fenster und Türen, um starken Luftzug zu vermeiden. Auf der sauberen und staubfreien Arbeitsfläche sollten sich nur die Geräte befinden, die Sie auch wirklich brauchen. Achten Sie darauf, daß die mitgelieferten Pipetten und Plastikschalen bis zum Versuch steril bleiben. Sogar das destillierte Wasser, das zum Lösen des Agars benötigt wird, ist häufig stark mit Mikroorganismen kontaminiert. Wenn der LB-Agar nicht sterilisiert werden kann, sollte deshalb nach Möglichkeit frisch destilliertes oder besser steriles, destilliertes Wasser aus der Apotheke verwendet werden.

  • Das LB-Medium ist ein idealer Nährboden für viele Mikroorganismen. Öffnen Sie daher die Gefäße mit dem Medium nur in unmittelbarer Nähe der Bunsenbrennerflamme und flammen Sie sie vor dem Wiederverschließen kurz ab. Verwenden Sie nur sterile Pipetten. Eine Pipette, mit der Sie bereits ein Glasröhrchen oder die Arbeitsfläche berührt haben, ist nicht mehr steril! Die Reaktionsgefäße sollten Sie nur am Rand anfassen, nicht an der Deckelinnenseite.

  • Auch das Gießen der Bakteriennährböden sollte neben der Flamme eines Bunsenbrenners geschehen, da dort die erwärmte Luft nach oben steigt und daher die Gefahr geringer ist, daß Luftkeime auf die Platte fallen.

  • Vorsicht! Lange Haare von der Flamme fernhalten!

  • Den Glasspatel, mit dem Sie die Bakterien ausplattieren, können Sie keimfrei machen, indem Sie ihn in ein Schälchen mit Ethanol tauchen und anschließend abflammen.

  • Vorsicht! Bringen Sie den Behälter mit Alkohol nicht in die Nähe der Flamme!

  • Achten Sie darauf, daß keine Tropfen brennenden Alkohols vom Glasspatel in die Schale fallen. Lassen Sie den Glasspatel vor dem Ausplattieren kurz abkühlen. Legen Sie ihn nach dem Abflammen nicht auf die Arbeitsfläche, sondern stellen Sie ihn mit dem Stiel in eine Halterung!

  • Pilzsporen und Dauerformen einiger Bakterien sind besonders hitzeresistent und werden selbst beim Aufkochen oft nicht abgetötet. Daher sollten Sie, wenn Sie die Nährböden einige Tage aufbewahren wollen, den LB-Agar vor dem Gießen autoklavieren, d.h. unter Überdruck (1 barü) auf etwa 121 °C erhitzen. Benutzen Sie dafür einen Dampfdrucktopf, den Sie mit nur wenig Wasser füllen. Kochen Sie darin den LB-Agar in einer nicht luftdicht verschlossenen Glasflasche etwa 20 Minuten lang. Der LB-Agar braucht in diesem Fall nur suspendiert zu werden, er löst sich während des Autoklavierens. Durchmischen Sie nach dem Autoklavieren den noch ca. 60 °C heißen Agar gleichmäßig durch Schwenken.

  • Um die Kontamination durch Luftkeime bei nicht sterilem Arbeiten im Unterricht zu demonstrieren, können Sie eine LB-Platte (ohne Ampicillin!) während einer Schulstunde ohne Deckel aufstellen und anschließend einen oder zwei Tage im Brutschrank inkubieren.
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