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BookmarkDie PCR in der medizinischen Diagnostik
Nachweis von Krankheitserregern
Das Aufspüren von Viren und Bakterien ist im Laufe der vergangenen zehn Jahre zum wichtigsten medizinischen Einsatzgebiet der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geworden. Sei es beim Nachweis von humanen Papillomviren, Hepatitis- und HI-Viren oder bei der Suche nach Chlamydien oder den Erregern einer Sepsis (Bakterien und Pilze): Das PCR-Verfahren löst in vielen Bereichen der Infektionsdiagnostik die klassischen Nachweisverfahren ab oder ergänzt sie. Diese klassischen Verfahren nutzen häufig immunologische Reaktionen und weisen Antikörper im Blut des Patienten nach, die dessen Immunsystem gegen die Eindringlinge gebildet hat. Solche Antikörper sind aber oft erst Wochen nach einer Infektion erkennbar (diagnostisches Fenster). Auch nach Ausheilung einer Infektion bleiben Antikörper im Blut der Betroffenen erhalten – in der Regel ein Leben lang. Da die Antikörper lediglich einen indirekten Hinweis auf die Erreger geben, sagt ihr Nachweis nichts darüber hinaus, ob eine Infektion frisch oder bereits ausgeheilt ist.
Die PCR erlaubt dagegen eine wesentlich frühere und exaktere Diagnostik, weil sie die DNS der Erreger direkt nachweist. Weil diese Erreger im Gegensatz zu ihren Antikörpern nach einer erfolgreichen Therapie verschwinden, lässt sich mit dem PCR-Verfahren genau bestimmen, ob und wann eine Infektion wieder ausgeheilt ist.
Für den PCR-Nachweis von Krankheitserregern gewinnt man die DNS aus Blut oder anderen Proben, gibt diese DNS in die Reaktionslösung und fügt Primer bei, die für das gesuchte Virus oder Bakterium charakteristisch sind. Wenn in dieser Probe nicht nur die Erbinformation des Patienten, sondern auch die DNS von Krankheitserregern enthalten ist, dann finden die Primer darauf den für sie passenden Bindungsort – und markieren so das entsprechende Stück der Erreger-DNS, das mithilfe der PCR vervielfältigt werden soll.
Auf diese Art lassen sich Mikroorganismen nicht nur im Menschen nachweisen, sondern prinzipiell in jeder beliebigen Probe, sei es in Körperflüssigkeiten, Nahrungsmitteln oder im Leitungswasser. Die PCR ist zu einem universellen Detektor von DNS-Spuren geworden.
Manche Viren, darunter HI-Viren, besitzen keine DNS als Erbgut, sondern RNS. Die RNS trägt ein anderes Zuckermolekül in ihrem Gerüst und enthält statt der Base Thymin (T) die Base Uracil (U). RNS-Viren verfügen deshalb über einen eigenen „Übersetzer“, das Enzym Reverse Transkriptase (RT). Damit verwandelt das Virus in der befallenen Zelle seine RNS in DNS, also in die Erbinformation der Zelle, denn nur dann kann es diese für seine Zwecke – seine Vervielfältigung – nutzen.
Entsprechend verfährt die Methode der Reversen Transkriptions-PCR (RT-PCR) zum Nachweis dieser so genannten Retroviren: Der Reaktionslösung wird Reverse Transkriptase beigefügt, die eventuell vorhandene Virus-RNS zunächst in DNS übersetzt und dann in einer PCR-Reaktion vervielfältigt.
Die quantitative PCR
Mit dem herkömmlichen PCR-Verfahren kann ermittelt werden, ob eine Probe einen gesuchten DNS-Abschnitt enthält (qualitative PCR). Sowohl in der Forschung als auch in der medizinischen Diagnostik ist es allerdings oft notwendig, die genaue Menge des gesuchten DNS-Abschnitts zu bestimmen. So ist es für die Verlaufskontrolle der medikamentösen Therapie von HIV-Infektionen zum Beispiel wichtig, die Zahl der Viren im Blut eines Patienten regelmäßig zu überprüfen, um entscheiden zu können, ob die Therapie anschlägt oder ein anderes Behandlungsregime angewendet werden muss.
Die exponentielle Verdoppelung des gewünschten DNS-Abschnittes funktioniert in der Mitte einer PCR-Reaktion am besten.
Theoretisch ist es zwar denkbar, aus dem Ergebnis einer PCR-Reaktion auf die Menge der ursprünglich vorhandenen DNS-Moleküle zu schließen. Praktisch ist das jedoch nicht möglich: Am Anfang können die Polymerasen noch nicht optimal arbeiten, weil es in der Reaktionslösung zu wenige Matrizen für ihre Arbeit gibt. Am Ende können die Polymerasen nicht mehr so gut arbeiten, weil sie durch den ständigen Temperaturwechsel geschwächt sind und immer weniger freie Basen zum Anbauen finden. Die exponentielle Verdoppelung funktioniert deshalb in der Mitte einer PCR-Reaktion am besten.
Deshalb haben Forscher die qualitative PCR mit Farbstoffreaktionen gekoppelt, was eine ständige quantitative Beobachtung des Reaktionsverlaufes ermöglicht (quantitative PCR). Diese so genannte Echtzeit-PCR (englisch: Real-Time PCR) lässt sich zum Beispiel mit TaqMan-Sonden durchführen: Das sind – ähnlich wie die Primer – kurze DNS-Stücke, die mit zwei farbempfindlichen Molekülen markiert sind, dem Reporter und dem Quencher. Diese Sonden lagern sich während der Hybridisierungsphase der PCR in der Mitte der einsträngigen Matrizen an.
Dabei wird das PCR-Reaktionsgefäß mit blauem Anregungslicht durchstrahlt. Der Reporter nimmt es auf, gibt die Energie dieses Lichtes aber an den benachbarten Quencher ab, der daraufhin rotes Licht aussendet. Wenn nun die Polymerasen nach der Hybridisierungsphase ihre Arbeit aufnehmen, versperren ihnen die TaqMan-Sonden irgendwann den Weg. Die Polymerasen können die Sonden aber ohne Schwierigkeiten abbauen – und trennen dabei auch die Verbindung zwischen Reporter und Quencher. Die Energieübertragung zwischen beiden wird unterbrochen – und der Farbstoffreporter beginnt nun, grünes Licht auszusenden. Die Stärke dieses grünen Lichtsignals wird photometrisch gemessen – sie ist proportional zur Menge abgebauter TaqMan-Sonden und damit auch zur Zahl der gebildeten DNS-Kopien.
Solange die TaqMan-Hydrolysesonde intakt ist und sich Reporter- und Quencher-Molekül in unmittelbarer Nähe zueinander befinden, wird das Reportersignal unterdrückt. Werden diese jedoch während der Tätigkeit der DNS-Polymerase voneinander getrennt, sendet der Reporter ein Fluoreszenzsignal aus, dass gemessen werden kann und einen direkten Rückschluss auf die gebildete DNS-Menge erlaubt.