Funktionsweise der PCR

Grundprinzip

Wie bei fast allen genialen Erfindungen ist auch das Prinzip der PCR ganz einfach. Sie besteht aus drei verschiedenen Reaktionsschritten, die nacheinander bei drei verschiedenen Temperaturen stattfinden. Für diese Schritte benötigt man:

  • die doppelsträngige DNS, die untersucht werden soll,
  • eine ausreichende Menge der vier verschiedenen Nukleotide, die aus je einem Phosphat- und Zuckermolekül sowie einer der vier Basen Adenin, Cytosin, Guanin oder Thymin bestehen,
  • so genannte Primer, das sind kurze DNS-Moleküle, die den Anfang und das Ende des DNS-Abschnittes markieren, das kopiert werden soll,
  • genügend viele Polymerasen.

1. Schritt: Der DNS-Doppelstrang wird in Einzelstränge zerlegt

Die Reaktionslösung wird mit allen Bestandteilen auf 95°C erhitzt. Die Bindungen zwischen den beiden Strängen der DNS – also zwischen ihren komplementären Basen – werden bei dieser Hitze aufgelöst, die beiden Einzelstränge trennen sich voneinander. Die DNS wird, so sagt die Fachsprache, denaturiert.

Abb.: DNS-Doppelstrang

Der DNS-Doppelstrang trennt sich bei Temperaturen von rund 95°C in seine Einzelstränge auf.

 

2. Schritt: Hybridisierung

Nun wird die Reaktionslösung auf 55°C abgekühlt. Dadurch kann sich an jeden der beiden Einzelstränge jeweils ein so genannter Primer binden und zwar an genau den Stellen, an denen die Kopie der DNS beginnen soll. Primer bestehen aus etwa 12 bis 20 Nukleotiden, die gezielt für den spezifischen DNS-Abschnitt hergestellt werden. Sie markieren den Startpunkt für die Tätigkeit der Polymerasen.

Abb.: Primer-Anneaal

Primer binden an jeden der beiden Einzelstränge und zwar an genau den Stellen, an denen die Kopie der DNS beginnen soll.

 

3. Schritt: DNS-Synthese

Damit die DNS-Synthese beginnen kann, muss die Temperatur wieder auf 72°C angehoben werden. Dies ist die ideale Arbeitstemperatur der verwendeten Polymerasen, die den Primer mit den ebenfalls zugesetzten DNS-Einzelbausteinen verlängern. Als Vorlage für diesen Vorgang dient die einzelsträngige DNS, die so wieder zum Doppelstrang komplettiert wird. Das doppelsträngige PCR-Produkt nennt man Amplikon.

Abb.: Elonga

Taq-Polymerasen verlängern den Primer mit den ebenfalls zugesetzten DNS-Einzelbausteinen. So wird die einzelsträngige DNS wieder zum Doppelstrang komplettiert.

Anschließend wird der Reaktionsansatz erneut auf 95°C erhitzt und ein neuer PCR-Zyklus beginnt. Im Idealfall verdoppelt jeder neue Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion die Menge des gewünschten DNS-Abschnittes. Dieser Prozess wird Amplifikation genannt, denn die neuen Amplifikate dienen im nächsten Zyklus ihrerseits selbst als Vorlagen für die Synthese neuer DNS-Stränge.

Die oben genannten Temperaturangaben entsprechen dem Standardprotokoll der PCR. Daraus ist inzwischen eine Vielzahl von Abwandlungen entwickelt worden, die für spezielle Anforderungen besser geeignet sein können.

Vervielfältigung der gewünschten DNS-Sequenz

Am Ende dieser ersten Runde des Kreislaufs ist noch nichts Nennenswertes geschehen. Aus einem Doppelstrang DNS sind zwei geworden. Erst in der zweiten Runde offenbart sich der geniale Trick der PCR. Trennt man die beiden Doppelstränge der ersten Runde erneut auf, dann entstehen dabei die ursprünglichen Ausgangsstränge sowie die beiden neu gebildeten Einzelstränge, von denen einer den ersten Primer und der andere den zweiten Primer enthält. Der Reaktionsprozess beginnt von vorne.

Wird jetzt zum zweiten Mal Primer angelagert, dann entsteht jeweils ein Strang, bei dem die Polymerase bei Primer 1 ihre Arbeit beginnt und bei Primer 2 abbricht und ein Strang, bei dem sie in Gegenrichtung bei Primer 2 beginnt und bei Primer 1 abbricht. Während die Original-DNS-Stränge lediglich über einen Startblock verfügen, gibt es auf den beiden Kopien der ersten Runde, den Amplifikaten, für jede Polymerase einen Startblock und eine Ziellinie: Deshalb sind nach der zweiten Runde des Kreislauf zwei Kopien des gewünschten DNS-Abschnittes entstanden. Nach der dritten Runde sind auf diese Art vier Kopien entstanden, nach der vierten acht, nach der zehnten 1.024 und so weiter. Theoretisch ergeben schon 20 Zyklen eine Million Kopien, 30 Zyklen bereits eine Milliarde, so dass nach dem Abschluss der PCR ausreichend Material für laboranalytische Messmethoden (Detektionsverfahren) zur Verfügung steht.

Abb.: Prinzip Ampli

Die Anzahl der Amplifikate verdoppelt sich in jeder PCR-Runde.

Die Primer, die für die Vervielfältigung des gewünschten DNS-Abschnittes ausgewählt werden, definieren den Anfang und den Endpunkt der PCR-Reaktion. Sie initiieren die Vervielfältigung sowohl auf der Original-DNS als auch auf den bereits gebildeten Amplifikaten. Die Amplifikate verfügen dabei über zwei durch den Primer klar definierte Enden – den Startblock und die Ziellinie – und enthalten dazwischen den gewünschten DNS-Abschnitt. An die Original-DNS dagegen bindet nur ein Primer. Daher besitzt sie nur ein definiertes Ende und wird über den gewünschten DNS-Abschnitt hinaus verlängert. Im Verlaufe der PCR-Zyklen vermehren sich die Amplifikate mit Startblock und Ziellinie exponentiell, während die Original-DNS nur linear zunimmt, so dass die Amplifikate mit dem gewünschten DNS-Abschnitt bald überwiegen.

Abb

Im Verlaufe der PCR-Zyklen vermehren sich die Amplifikate exponentiell.

Tools

Services

Hilfe aus heißen Quellen

Abb.: Heisse Quelle

Das Bakterium Thermophilus aquaticus (abgekürzt: Taq) lebt in den heißen Quellen des Yellowstone Nationalparks.

Das ursprüngliche PCR-Verfahren konfrontierte die Forscher mit einem gravierenden Problem: Sie mussten die benötigten Polymerasen in jeder Runde neu in die Reaktionslösung füllen, denn bei Temperaturen von 95°C, die für den ersten Reaktionsschritt nötig sind, zerfällt nicht nur die DNS in ihre Einzelstränge; auch die Polymerasen werden zerstört. Sie verrichten ihre Arbeit normalerweise bei einer Körpertemperatur von 37°C.

Die Lösung dieses Problems fanden Forscher um Kary Mullis, der zum Zeitpunkt seiner Erfindung für die Firma Cetus arbeitete, in den heißen Quellen des Yellowstone Nationalparks. Dort lebt das Bakterium Thermophilus aquaticus (abgekürzt: Taq) bei extremen Temperaturen, die bis an den Siedepunkt des Wassers reichen. Die aus diesem Bakterium isolierte Taq-Polymerase ist hitzestabil, so dass sie Temperaturen von 95°C, die zur Trennung der DNS in ihre Einzelstränge nötig ist, problemlos überstehen kann. Die Taq-Polymerase wird seit 1987 für die PCR verwendet. Erst die Entdeckung dieses hitzestabilen Enzyms ermöglichte die Automatisierung und damit den Siegeszug der PCR in den Labors der Welt.