Grippe-Epidemien diagnostisch bewältigen – Influenza-Diagnostik über den cobas omni Utility Channel

Artikel aus Diagnostik im Dialog (Ausgabe 58)

[Laborprozesse] 15 Wochen dauerte die Grippewelle der Saison 2017/18! Allein in der Kalenderwoche (KW) 10/2018 wurden ca. 60.000 Influenzanachweise an das Robert Koch Institut (RKI) gemeldet (Abb. 1). Insgesamt stiegen die Fallzahlen gegenüber der Influenza-Saison 2016/17 um ca. 65 %.2 Immer wieder stellt die Diagnostik der Influenza A und B viele Krankenhäuser und Einsender-Labore während der Epidemiezeit vor große Herausforderungen. Denn die plötzlichen Anforderungswellen be- bzw. überlasten die Laborkapazitäten. Der diagnostische Workflow über den cobas omni Utility Channel am cobas 6800/8800 System automatisiert das Probenmanagement auch bei Lab Developed Tests (LDT). So war es uns möglich, die Grippewelle ohne Sonderschichten zu bewältigen.

Die lang anhaltende Grippewelle der Saison 2017/18 begann in der 52. KW 2017, erreichte während der 8. bis 10. KW 2018 ihren Höhepunkt und endete nach Definition der Arbeitsgemeinschaft Influenza in der 14. KW 2018 (Abb. 11). Influenza-B-Viren (mit 99 % aus der Yamagata-Linie) waren mit 68 % die am häufigsten identifizierten Erreger, gefolgt von Influenza-A(H1N1)pdm09-Viren mit 28 % und Influenza-A(H3N2)- Viren mit 4 %.3

Spitzenbelastungen meistern

Wie lassen sich solche kaum planbaren Spitzenbelastungen im diagnostischen Labor bewältigen? Moderne Automaten für die Nukleinsäurepräparation (z. B. MagNA Pure 96, Roche) und für die Amplifikation im 96er- oder sogar 384er-Mikrotiterplattenformat mittels LightCycler (LC)480 System (Roche) bieten einen hohen Durchsatz – das Probenmanagement allerdings bleibt mit viel Arbeitsaufwand verbunden.

Mit dem Influenza A/B, RSV Assay von IDT (Integrated DNA Technologies, Belgien), der für die Nutzung auf dem cobas omni Utility Channel der cobas 6800/8800 Systeme optimiert wurde, lässt sich dieser Vorgang nun komplett automatisieren. Die Hands-on-time reduziert sich auf ein Minimum. Bei entsprechender Präanalytik, mit speziellen Probenröhrchen (s. u.) vermeidet man darüber hinaus den Umgang mit potentiell infektiösem Probenmaterial (z. B. Rachenabstrichen).

Influenza-Meldedaten gemäß Infektionsschutzgesetz (1)


Workflowkomponenten

Welche Komponenten benötigt die Durchführung des IDT Influenza A/B, RSV Assays?

  • cobas 6800 oder cobas 8800 System: Die molekulardiagnostischen Vollautomaten stehen in großen Laboratorien, insbesondere mit vielen HIV-1-, HCV-, HBV-Viruslastproben bzw. CT/NG-Anforderungen, bereits häufig für die Routinediagnostik zur Verfügung.
  • Spezielle Probenröhrchen: Die cobas PCR media tubes – üblicherweise eingesetzt für die CT/NG-Diagnostik – sind mit 4,4 ml Lysepuffer (cobas PCR Medium) vorgefüllt. Dadurch finden bereits während des Transports Zelllyse und Stabilisierung der Target-RNA statt.
  • Reagenzkassette für den cobas omni Utility Channel: Der Testkit für 96 Analysen unterscheidet sich von den Routinetests auf cobas 6800/8800 nur durch ein extra beigefügtes Röhrchen mit einem Mastermix ohne Primer und Sonden.
  • Primer und Sonden: Die Influenza- (und RSV-) spezifischen Primer und Sonden werden online bei IDT als Influenza/RSV qPCR Assay bestellt und meist kurzfristig (nach ca. 3 Arbeitstagen) geliefert. Primer und Sonden werden dem Mastermix (s. o.) in einem festen Volumenanteil zugegeben, gemischt und anschließend in den vorgesehenen Platz der Reagenzkassette gefüllt.
  • Spezifische Software: Zur Verwendung des so hergestellten Testkits auf cobas 6800/8800 muss das cobas omni Utility Channel Software Tool auf einem externen Rechner installiert sein, der über ein sogenanntes Remote User Interface mit dem Analyzer verbunden ist. Im Software Tool wird das PCR-Testprogramm erstellt und auf den RFID**-Chip, der sich auf der Reagenzkassette befindet, übertragen. Der RFID-Reader/Writer ist ein kleines, über USB an den Rechner anschließbares Kästchen.

Ist die cobas omni Utility Channel Reagenzkassette als Influenza-Test für cobas 6800/8800 markiert, kann sie, wie jeder andere Test, in das Gerät geladen und von der Systemsoftware verwaltet werden. Im weiteren Handling besteht kein Unterschied zu IVD-Testen. Da es sich bei der vorgestellten Influenzaanalytik um eine LDT-Methode handelt, ist allerdings zu beachten, dass potentielle Anwender zu jeder Zeit für die Etablierung des Tests (z. B. Festlegung von Cut-off-Werten und QC-Regeln), seine Durchführung und die klinischen Ableitungen selbst verantwortlich sind.

Probenmanagement

Die Abstrichtupfer werden direkt in die cobas PCR media tubes gegeben, die Stiele abgebrochen und die Röhrchen wieder verschlossen. Dies kann entweder direkt bei der Probennahme in der Arztpraxis bzw. der Krankenstation oder nachträglich im Labor erfolgen – wie es z. B. bei uns gehandhabt wird. In diesem Fall sollten möglichst trockene Tupfer ohne Medium verwendet werden.

Auch mit anderen Abnahmesystemen, wie den bakteriologisch/molekularbiologischen eSwab-Kombiabstrichen (Copan Diagnostics INC, USA) lässt sich weiter arbeiten, entweder direkt aus dem Medium der Originalröhrchen – was allerdings ein zusätzliches paralleles Präparationsprotokoll im cobas 6800/8800 System erfordert – oder man überführt maximal 1 ml des eSwab- Mediums in das cobas PCR media tube. Der Vorteil dieser Vorgehensweise liegt u. a. in der sofortigen Lyse der Viruspartikel mit Stabilisierung der Virus-RNA, wodurch die Probe nicht mehr infektiös ist. Die Proben sind so theoretisch mehrere Tage bei Raumtemperatur oder gekühlt stabil. Wir haben z. T. noch Wochen später Vergleichsanalysen mit anderen Influenza-PCR-Testsystemen durchgeführt. Auch die einmal erstellte Positivkontrolle im cobas PCR media tube kann, je nach Füllmenge, an mehreren Tagen bis zu zehnmal eingesetzt werden.

Die so vorbereiteten cobas PCR media tubes werden nach Entfernen des Deckels zusammen mit den enthaltenen abgebrochenen Abstrichtupfern (deren Entnahme nicht notwendig ist) analog der Blutröhrchen in die Systemracks des Analyzers gestellt und verarbeitet. Das System schleust die Röhrchen direkt nach Pipettierung des Probenvolumens für die automatische Präparation wieder aus, so dass die Proben zeitnah auch für andere PCR-Applikationen (z. B. weitere virale oder bakterielle respiratorische Parameter) zur Verfügung stehen. Alternativ kann dem Probenröhrchen auch ein Teil des Lysepuffers vorab für andere Zwecke entnommen werden, da die cobas 6800/8800 Systeme für die Pipettierung nur ein Maximalvolumen von ca. 1 ml (inkl. Totvolumen) benötigen.

Die Bearbeitungszeit der Influenza-Proben entspricht mit ca. 2:45 h für 96 Analysen auf cobas 6800 exakt der für die Routineparameter. Die Ergebnisse erscheinen im vertrauten Report als Kontrollbatch. Jeder Parameter – Influenza A, Influenza B und RSV – ist in einem Target-Kanal als negativ oder mit einem ermittelten Ct-Wert*** als positiv gelistet. Die in der Reagenzkassette enthaltene und mitpräparierte interne Kontrolle (IC) wird in einem weiteren Kanal gelistet und zeigt die Validität jeder einzelnen Probe an. Als obligatorische und für die Validität des Testlaufs erforderliche Negativkontrolle dient das cobas Buffer Negative Control Kit.

Die Positivkontrolle muss man sich (wie bei allen LDT) selbst zusammenstellen bzw. als kommerzielles Produkt für Influenza A/B und RSV erwerben und wie eine Untersuchungsprobe mitlaufen lassen.

Erfahrung

Wir haben von Ende Januar bis ca. Mitte April 2018 den größten Teil unserer Influenza- Diagnostik mit Hilfe des Influenza/RSV qPCR Assays von IDT auf dem cobas omni Utility Channel abgearbeitet – in bis zu drei Ansätzen pro Tag. Die Läufe waren zeitlich so angesetzt und gestaffelt, dass alles in der üblichen Laborzeit bis ca. 19 Uhr fertig wurde. Bei späten Proben lief das cobas 6800 System zusätzlich über Nacht, diese Ergebnisse lagen dann am Morgen nach Arbeitsbeginn vor. Theoretisch kann das System ca. alle 1,5 h ein neues 96-er Probenbatch aufnehmen und in ca. 2:45 h analysieren.

Die Testperformance auf dem cobas 6800 System ist genauso gut – wenn nicht sogar besser – wie mit unseren klassischen Real-Time-PCR-Verfahren, z. B. auf dem LC480 System (Roche) oder der Rotor-Gene Plattform (Qiagen). Hinzu kommt als großer Vorteil die „dramatische“ Minimierung der Hands-on-time, da Probenpräparation, PCR-Ansatzpipettierung und Auswertung vollautomatisch ablaufen. Die System-Software überträgt die Ergebnisse online in das Labor Informationssystem (LIS).

Alles in allem haben wir aus der vergangenen Grippesaison die Erkenntnis gewonnen, dass das cobas 6800 System für die Arbeit im molekularbiologischen Labor (auch und gerade beim Einsatz von LDT) eine große Arbeitserleichterung und ein nicht zu unterschätzendes zeitliches Einsparpotential bedeutet. Nach unseren diesjährigen Erfahrungen sehen wir der Influenza-Saison 2018/2019 – was unsere diagnostischen Kapazitäten betrifft – deutlich gelassener entgegen.


* RSV: Respiratory Syncitial Virus

** RFID (radio-frequency identification): Technologie für Sender-Empfänger-Systeme zum automatischen und berührungslosen Identifizieren, Beschreiben und Lokalisieren von Objekten mittels Radiowellen.

*** Ct-Wert (threshold cycle): Theoretische Größe, die den Anfang des exponentiellen Wachstums einer Kurve beschreibt, d. h. wenn die Fluoreszenz erstmals exponentiell über den Hintergrundwert ansteigt.


Literatur

  1. https://influenza.rki.de/Diagrams.aspx?agiRegion=0

  2.  https://www.deutsche-apotheker-zeitung.de/news/artikel/2018/04/18/grippeimpfung-haette-5000-menschenretten-koennen

  3.  Arbeitsgemeinschaft Influenza: https://influenza.rki.de/Wochenberichte/2017_2018/2018-24.pdf


Korrespondenzadresse


Dr. rer. nat. Heiko Petersen

Dr. rer. nat. Heiko Petersen
Leiter Molekulare Erregerdiagnostik
MVZ Labor Dr. Fenner und Kollegen
Bergstraße 14
20095 Hamburg
hpetersen@fennerlabor.de



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