Unter dem Begriff Molekulardiagnostik verstehen wir den Nachweis krankheits-, diagnose- und therapierelevanter genetischer Veränderungen im Erbgut der Menschen. Die Vermehrung von Erbsubstanz (DNA) durch Polymerase-Kettenreaktion bildet hierbei die Basis der Untersuchungsverfahren.2,3

In der Medizin kommt die Molekulardiagnostik häufig zum Einsatz, wenn es darum geht, frühzeitig Infektionskrankheiten zu diagnostizieren, Risiken zu erkennen und eine Entscheidung zu fällen, welche Therapie für den betroffenen Patienten die größte Chance auf Heilung seiner Krankheit hätte.4

Das Labor für „Molekulare mikrobiologische Diagnostik“ der Medizinischen Hochschule Hannover befasst sich unter anderem mit folgenden Tätigkeitsfeldern: erstens mit molekularbiologischen Methoden zur Identifizierung. Zweitens mit der Typisierung von Erregern. Und drittens mit dem Feststellen von Antibiotikaresistenzen. Das Tätigkeitsfeld des Labors umfasst noch zahlreiche weitere Fachgebiete, auf die wir an dieser Stelle nicht weiter eingehen.5

Der Bereich der Identifizierung von Erregern beruht auf Echtzeit basierten single-plex und multi-plex PCRs aus Patientenmaterial. Hinzu kommen gezielte Gensequenzierungen zur Identifikation von bestimmten Pilzen und Bakterien.5

Im Bereich der molekularen Typisierung von Erregern erstellt das Labor für klinisch-mikrobiologisch relevante Bakterien Schemata, um so nosokomiale Ausbrüche von Krankheitserregern schnell und zuverlässig zu detektieren.5

Das Feststellen von Antibiotikaresistenzen ist eine weitere tragende Säule der molekularbiologischen Diagnostik, welche durch Forschungsprojekte weiterentwickelt wird. Hier liefern zum Beispiel im Fall von komplexen Resistenzmustern kulturbasierte Resistenztestungen zum Teil schwer interpretierbare Ergebnisse. Das erschwert sowohl die Planung der Therapie sowie das Management der Krankenhaushygiene.5

Bei der PCR handelt es sich um eine Technik, welche die Analyse einer kurzen DNA-Sequenz durch Vervielfältigung eines ausgewählten DNA-Abschnitts möglich macht. PCR ist eine relativ sensible Methode, da für eine einzige Reaktion nur sehr geringe Mengen benötigt werden.

Die Technik beruht auf der Fähigkeit der DNA-Polymerase, neue DNA-Stränge komplementär zum angebotenen Vorlagenstrang zu synthetisieren. Das Reaktionsgemisch der PCR besteht aus DNA-Polymerase, DNA-Nukleotiden, Primern, der zu amplifizierenden DNA-Vorlage und Magnesium. Die Amplifikation wird in einem Thermocycler durchgeführt.

Die DNA-Polymerase benötigt einen bereits existierenden DNA-Strang am 3′-Ende, um einen neuen Strang zu synthetisieren. Daher wird zur Einleitung der DNA-Synthese der Reaktionsmischung ein Oligonukleotid-Primer zugesetzt. Die Verwendung eines Primers in der PCR ermöglicht die Amplifikation nur einer bestimmten Region in der Vorlage. Die Zielsequenz wird durch Vorwärts- und Rückwärtsprimer flankiert.

Am Ende einer PCR werden neue Kopien einer bestimmten DNA-Sequenz, sogenannte Amplikons angehäuft. Die Komponenten der PCR sollten so optimiert werden, dass die PCR-Leistung verbessert und gleichzeitig die Fehlerquote minimiert wird.

Bei qPCR handelt es sich um eine Methode, die den Nachweis und die Quantifizierung von Nukleinsäuren für verschiedene Anwendungen ermöglicht. Für die qPCR verwendet man sowohl DNA als auch RNA. Wenn man RNA als Matrize verwendet, sollte sie zunächst in cDNA umgeschrieben werden. Bei der qPCR verwendet man hingegen Fluoreszenzfarbstoffe, um das PCR-Produkt in jedem Schritt des PCR-Zyklus zu markieren.

Dieses Vorgehen ermöglicht die Erfassung von Daten im Verlauf der PCR und erlaubt die Quantifizierung der Amplikons während der exponentiellen Phase der PCR.. Da die Fluoreszenz proportional zur Menge der amplifizierten DNA zunimmt, kann die Quantifizierung in "Echtzeit" erfolgen. Der Hauptnachteil der Verwendung von Farbstoffen besteht darin, dass sie nur die Quantifizierung eines bestimmten Produkts in der Probe ermöglichen.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) sind beides Techniken, die zur Vervielfältigung von DNA für verschiedene Zwecke eingesetzt werden. Der größte Unterschied zwischen beiden Techniken besteht darin, dass die PCR eine qualitative Technik ist, während die qPCR eine quantitative Technik ist. Bei der PCR kann das Testergebnis als Vorhandensein oder Fehlen abgelesen werden. Bei der qPCR hingegen wird die Menge der in jedem Zyklus amplifizierten DNA quantifiziert.

Für das zu vervielfältigende menschliche Erbgut werden in einem Thermocycler zunächst drei Elemente zusammengebracht:

1. Spezielle Primer
   Hierbei handelt es sich um kurze DNA- oder RNA-Stücke. Diese dienen bei der Vervielfältigung der DNA als Startmolekül.

2. Freie Nukleotide

   Ein Nukleotid ist ein Molekül und der kleinste Baustein von Nukleinsäuren. Diese bestehen aus Makromolekülen, die bei Organismen die genetische Information enthalten. Mit anderen Worten: Ein Nukleotid stellt den Grundbaustein der DNA (und RNA) dar. 8, 9

3. DNA-Polymerasen

   Hierbei handelt es sich um ein Enzym, das für die Herstellung von Desoxyribonukleinsäure (DNA), sprich identischer DNA-Kopien, zuständig ist. Mithilfe von DNA-Polymerasen können bei der Polymerasen-Kettenreaktion DNA-Abschnitte vervielfältigt werden.10

Ein Thermocycler ist ein Gerät, dass es ermöglicht, mehrere Thermozyklen einer PCR vollautomatisch hintereinander durchzuführen. Denn dies ist erforderlich, um eine genügende Menge an DNA zu vervielfältigen. Als Ausgangsmaterial reicht bereits ein DNA-Doppelstrang aus, um eine PCR auszuführen, wobei pro Temperaturzyklus die Anzahl der DNA-Doppelstränge exponentiell (1, 2, 4,16 …) ansteigt.

Die PCR verläuft in drei Schritten:

1. Denaturierung

   Bei der Denaturierung wird das Erbgut auf etwa 90° C erhitzt. Dadurch lösen sich die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen auf und die DNA wird in ihre Einzelstränge aufgetrennt.

2. Hybridisierung

   Die spezifischen Primer lagern sich bei etwa 60° C an die 3' Enden der DNA Einzelstränge an. Dabei gilt das Prinzip der Komplementarität: Die spezifischen Primer können sich nur an ein komplementäres Gegenstück (Adenin mit Thymin und Cytosin mit Guanin) anlagern.

3. Polymerisation

   Im 3. Schritt wird die Temperatur auf zirka 70° C erhöht. Infolgedessen beginnen die DNA-Polymerasen an den Primern von 3' nach 5' mit der Anlagerung von komplementären Basen. Das Ergebnis: Aus zwei DNA- Einzelsträngen entstehen so zwei DNA-Doppelstränge.

Im Anschluss werden diese drei Schritte mehrfach hintereinander wiederholt. Dabei steigt pro Zyklus die Anzahl der DNA-Doppelstränge exponentiell an. Es werden meistens etwa zwischen 30 und 50 Zyklen durchgeführt. 7

Für die Größenfraktionierung der PCR-Produkte wird die Agarosegel-Elektrophorese verwendet. Das Produkt wird mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht betrachtet. Das PCR-Produkt oder die amplifizierte DNA kann zur Klonierung, Sequenzierung oder Genotypisierung verwendet werden.6

Es gilt, den manuellen Aufwand für sich wiederholende Routinearbeiten zu minimieren - wenn nicht gar zu eliminieren, die Durchlaufzeit zu verkürzen und das Testvolumen zu erhöhen. Das gelingt Ihnen aber nur dann, wenn Sie die Analytik in Ihrem Labor automatisieren.

Dadurch vereinfachen, standardisieren und verkürzen Sie die Arbeitsprozesse. Sie minimieren das Kontaminations- und Verletzungsrisiko. Und Sie schließen menschliche Fehler, wie zum Beispiel Verwechslungen beim Etikettieren von Probenröhrchen aus.

Außerdem können Sie Ihre Laborfachkräfte für qualifizierte Aufgaben einsetzen. Dies führt zu einer höheren Motivation, mehr Engagement und in Verbindung mit der kürzeren Durchlaufzeit zu mehr Produktivität und höherer Rentabilität Ihres Labors.11