Bakterielle DNA wird durch eine Echtzeit-PCR analysiert. Dabei wird ein 75 bp langes Fragment des lytA-Gens von Streptococcus pneumoniae amplifiziert und mit einer Coumarin-markierten Sonde im Kanal 1 analysiert. Ein 69 bp langes Fragment des IS481-Gens von Bordetella pertussis/holmesii wird mit einer FAM-markierten Sonde im Kanal 2 analysiert. Ein 80 bp langes Fragment des IS1001-Gens von Bordetella parapertussis/bronchiseptica wird mit einer HEX-markierten Sonde im Kanal 3 analysiert. Ein 137 bp langes Fragment des siaT-Gens von Haemophilus influenzae wird mit einer JA270-markierten Sonde im Kanal 4 analysiert.

Dieser Assay erkennt mindestens 92 genomäquivalente Kopien oder weniger pro mL für Streptococcus pneumoniae, 68 Kopien oder weniger pro mL für Bordetella pertussis, 82 Kopien oder weniger pro ml für Bordetella parapertussis und 105 Kopien oder weniger pro mL für Haemophilus influenzae. Bestimmt durch PROBIT mit einer Trefferquote von 95 % (LoD für 200 μL Probenvolumen, die mit Plasmid-DNA gespickt sind).